（3）
巧合太多了，就不再是巧合了。
接续：新冠中的跨物种、跨生物界、超生物基因 2
I SARS-CoV-2对冠状病毒基因的继承、借鉴、模仿、优化、集成（续二）
MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV，及S1/S2处的多重借鉴
FCS：furin cleavage site，furin切割位点或furin酶切位点。furin（弗林）是一种在人体中几乎无处不在的前体蛋白转化酶（proprotein convertase），furin也广泛存在于脊椎动物和部分无脊椎动物组织、细胞中。
SARS-CoV-2 S1/S2处的furin切割位点（FCS）使其Spike蛋白可在细胞外被furin等人体蛋白酶高效切割，使Spike的膜融合亚基--S2亚基暴露、激活，介导病毒包膜与细胞膜直接膜融合，膜融合后向细胞质中释放包膜内的病毒RNA，第一时间启动复制，大幅提升了感染、复制效率，大幅扩展了在人体内的组织向性（tissue tropism）和感染范围，大幅增强了致病能力。furin蛋白酶在人体中几乎无处不在，S1/S2处的高效FCS是SARS-CoV-2具有泛组织、泛器官感染、侵犯能力并造成广泛后遗症的关键结构因素。
注：SARS-CoV-1的Spike没有FCS，不能在细胞外被水解切割（除非在有胰蛋白酶的肠道中），它的病毒包膜不能直接与细胞膜发生膜融合。完成受体结合后，SARS-CoV-1将被整体内吞，内吞后其Spike需要在在内吞体或溶酶体中被细胞内的组织蛋白酶B或L（CatB/L）水解切割，而后，病毒包膜再与内体膜或溶酶体膜发生膜融合以释放病毒RNA，至此病毒才有机会启动复制。
S1/S2处，指冠状病毒Spike蛋白S1亚基（受体结合亚基）、S2亚基交界处。
1、RRARR借鉴
SARS-CoV-2 S1/S2处的基本furin切割序列RRAR（精氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸）借鉴自小鼠肝炎病毒MHV-JHM、MHV-3株系，以及猫冠状病毒（FIPV、FECV）某些病毒株等病毒S1/S2处的furin切割序列RRARR、RRAR。
基本furin切割序列，也叫最小furin切割序列，指符合“RXXR”模式的四氨基酸序列，该模式的首尾氨基酸都是精氨酸。R是精氨酸的单字母缩写。
SARS-CoV-2 S1/S2处的PRRA插入及由此产生的RRAR切割序列
SARS-CoV-2 Spike蛋白构成，S1/S2处的RRAR FCS／切割序列
SARS-CoV-2 RRAR切割序列的最后一个精氨酸R是S1亚基的最后一个氨基酸（残基），其后的丝氨酸S是S2亚基的第一个氨基酸（残基），furin蛋白酶将在这两个氨基酸之间水解、切割Spike蛋白。蛋白质、多肽中的氨基酸形成肽键相连时会释放2个H原子和一个氧原子，其剩余部分称为氨基酸残基。为方便，本文将忽略氨基酸残基与氨基酸的严格区分，将氨基酸残基也称为氨基酸。
S2'是SARS-CoV-2 Spike蛋白的另一个蛋白酶切割位点，它位于S2亚基融合肽（fusion peptide，FP）之前，具有二元氨基酸切割序列KR（赖氨酸-精氨酸）。
小鼠肝炎病毒MHV-JHM株系、MHV-3株系S1/S2处的复合furin切割序列皆为RRARR，它包含两个基本furin切割序列：RRAR、RARR，前者就是SARS-CoV-2 S1/S2处的基本furin切割序列。
几个MHV株系S1/S2（“|”）处的aa序列
小鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）有超过25个株系，其中多个株系S1/S2处存在FCS，S1/S2处切割序列为RRARR的MHV-JHM、MHV-3是毒力（致病能力）最强、次强的两个MHV株系。MHV-JHM也叫MHV-4。
猫冠状病毒（Feline CoV）包括FIPV、FECV两个分支。FECV指猫肠道病毒（feline enteric coronavirus），毒力通常较温和；FIPV指猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis Virus），毒力强烈。FECV会突变为FIPV并变得致命。FIPV也称为猫冠状病毒I型（FCoV-1）， FECV则称为猫冠状病毒II型（FCoV-2）。
FIPV、FECV S1/S2处的aa序列（amino acid sequence，氨基酸序列）较为多变，某些FIPV、FECV毒株S1/S2处也具有furin切割序列RRARR或RRAR。
某些FIPV病毒株S1/S2处的RRARR、RRAR切割序列
某些FECV病毒株S1/S2处的RRARR切割序列
SARS-CoV-2是β谱系B支系（乙型冠状病毒属Sarbe亚属）冠状病毒，MHV是β谱系A支系（乙型冠状病毒属Embe亚属）冠状病毒。虽然同属β谱系，但SARS-CoV-2与MHV结构差异巨大、演化距离极远。SARS-CoV-2、MHV-JHM全基因组序列（核苷酸序列）仅有23%具有可比对性（即二者77%的序列几无相似之处），23%可比对部分的一致度仅为66.79%；SARS-CoV-2、MHV-JHM二者Spike蛋白aa序列有92%可比对，但可比对部分的一致度仅为36.65%。
猫冠状病毒（FIPV、FECV）是α谱系（甲型冠状病毒属）冠状病毒，与SARS-CoV-2演化距离更为遥远。冠状病毒共分四个谱系（属）。
SARS-CoV-2 S1/S2处的RRAR切割序列不太可能自然来自MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV等病毒S1/S2处的切割序列RRARR或RRAR，SARS-CoV-2不太可能源自这些病毒的自然演化，或与其它病毒的自然重组。
科学界在病毒中插入furin切割位点/furin切割序列，或改造、替换病毒中furin切割序列的历史超过了25年。
疫情前的多项研究表明，RRARR是水解切割效能极佳的furin切割序列。早在1995年12月（01 Dec 1995），荷兰莱顿大学（Leiden University）医学院微生物学院病毒学系已对MHV-JHM、MHV-A59 S1/S2处的furin切割序列进行了改造、替换、对比研究，并实验证明，RRARR的切割效果显著高于MHV-A59的furin切割序列RRAHR，RRARR将导致更高比例的Spike蛋白被furin蛋白酶水解切割。H是组氨酸的单字母缩写。
相关论文：
Mutational Analysis of the Murine Coronavirus Spike Protein: Effect on Cell-to-Cell Fusion
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682285700566
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7131709/pdf/main.pdf
作为RRARR一部分的RRAR也是非常高效的furin切割序列。疫情发生后，华中科技大学同济药学院发表于October 05, 2020的一篇iScience论文实验证明：SARS-CoV-2的“RRAR”基序（motif）是一个非常高效的furin酶切序列，它很容易被furin蛋白酶识别和水解，相比经典的furin酶切序列RVRR，RRAR在furin蛋白酶作用下的水解、裂解效率是RVRR的2倍。
相关论文：
Furin: A Potential Therapeutic Target for COVID-19
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30834-8
分别含有RRAR、RVRR切割序列的多肽的水解效率对比图
RFU：Relative Fluorescence Units，相对荧光单位/相对荧光强度
RVRR是发现于土耳其的一种H7N1高致病性禽流感病毒毒株的furin切割序列，高致病性流感病毒通常具有高效的furin切割序列。
另有论文实验表明，除furin蛋白酶外，SARS-CoV-2 S1/S2处的furin切割位点/切割序列还可被多种其它蛋白酶高效切割，如PC1（Proprotein convertase 1，前蛋白转化酶1）、trypsin（胰蛋白酶）、martiptase（基质蛋白酶）、Cathepsin B（组织蛋白酶B）等等。
SARS-CoV-1 、SARS-CoV-2 S1/S2位点多肽在不同蛋白酶作用下的水解效率对比图
相关论文：
Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel S1_S2 Site
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30397-7
在小鼠肝炎病毒（MHV）25个以上株系中，S1/S2处切割序列为RRARR的MHV-JHM（MHV-4）、MHV-3是毒力（致病能力）最强的两个株系，它们对BALB/c小鼠（白变种实验室小鼠）的感染致死率接近100%。MHV-JHM具有高度神经毒性，它引发使小鼠瘫痪、死亡的强烈脑炎。S1/S2处切割序列为RRAHR的MHV-A59也是毒力较强的MHV株系但毒力显著弱于MHV-JHM和MHV-3。MHV-JHM、MHV-3的强大毒力很大程度上与S1/S2位处的RRARR切割序列有关。
FIPV（Feline Infectious Peritonitis Virus，猫传染性腹膜炎病毒）是猫传染性腹膜炎的病原体。猫传染性腹膜炎的病变部位不只腹膜，它是猫的一种全身性系统性绝症，在有效药物出现前，感染FIPV的猫一年感染死亡率为100%。FIPV也具有大脑、中枢神经系统（CNS）感染、侵犯能力，可导致猫脑膜炎。
RRARR、RRAR的高效酶切特性和强大促膜融合能力（除了介导病毒包膜-细胞膜融合外，还可诱导宿主细胞间发生膜融合形成合胞体）可能有助于病毒突破血脑屏障（blood-brain barrier），感染、侵犯宿主大脑和中枢神经系统。MHV-JHM、MHV-3、FIPV都具有大脑、中枢神经系统侵犯能力，都可能引发脑炎、脑膜炎及其它大脑、神经损伤。S1/S2处的RRAR切割序列可能是SARS-CoV-2具有大脑、神经系统侵害能力的结构因素之一。
小鼠是病原体/病毒研究中使用最广泛的实验室动物，MHV被长期作为冠状病毒研究的模型系统，是研究最为广泛、最为深入的一类病毒；在20多个MHV株系中，被研究最多的三个株系是MHV-JHM、MHV-3、MHV-A59；猫冠状病毒（FIPV、FECV）可能是仅次于鼠冠状病毒，被研究次多的一类动物冠状病毒。但是，自疫情发生至今，“大牌”病毒学家、重量级媒体们一直避而不谈，一直未告知公众，SARS-CoV-2 S1/S2处RRAR切割序列，与MHV-JHM、MHV-3、FIPV、FECV S1/S2处RRARR（、RRAR）切割序列的显著关联和相似性。
2、异常的PRRA插入及FCS
虽然很多冠状病毒、非冠状病毒具有furin切割位点（FCS），但是，SARS-CoV-2 S1/S2处的FCS及RRAR切割序列极不正常，这是因为，与SARS-CoV-2演化关系较近的冠状病毒无一具有FCS，更无一具有RRAR切割序列；具有FCS的冠状病毒全都与SARS-CoV-2 演化关系极远。具体而言：
1）、在SARS-CoV-2 所属的β谱系B支系（乙型冠状病毒属Sarbe亚属），只有一种病毒具有FCS，就是SARS-CoV-2；
2）、只有极少数蝙蝠冠状病毒具有FCS（少数例外之一是伏翼蝠冠状病毒BatCoV-HKU5）；
3）、所有与SARS-CoV-2 spike蛋白同源性大于40%的冠状病毒的Spike都不具有FCS（当然更不会具有S1/S2处的RRAR切割序列）。
spike蛋白同源性，就是spike蛋白aa序列（氨基酸序列）相似度。第3点是华中科技大学同济药学院October 05, 2020 iScience论文的生物数据库搜索、比对结论。
论文原文：
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not possess a furin cleavage site
Furin: A Potential Therapeutic Target for COVID-19
https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(20)30834-8
SARS-CoV-2的RRAR切割序列由其特有的四氨基酸插入PRRA（脯氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸）的后三个氨基酸RRA与其后的精氨酸R组成，这个精氨酸是S1亚基的最后一个氨基酸。
部分β谱系B支系冠状病毒S1/S2位点附近的aa序列比对
上图显示了SARS-CoV-2 特有的PRRA插入、基本furin切割序列RRAR、长furin切割序列RRARSVAS。长furin切割序列RRARSVAS下一篇文章还会再涉及。
下图显示了更多β谱系B支系冠状病毒S1/S2位点附近的aa序列。
β谱系B支系部分人类、果子狸、貉、穿山甲、蝙蝠冠状病毒局部氨基酸序列比对
由图可见，SARS-CoV-2的PRRA插入在同支系冠状病毒中极为突兀、异常。
再从进化树（系统发育树）视角对比一下SARS-CoV-2 与其它冠状病毒的S1/S2处的aa序列：
SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1毒株）与进化树中冠状病毒S1/S2附近的aa序列比对
SARS-CoV-2异常的PRRA插入在上图中更显突兀、刺眼；上面两个图中，S1/S2处具有furin酶切位点（FCS）的冠状病毒只有SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2的四氨基酸插入PRRA在β谱系B支系冠状病毒pike蛋白中是独一无二的，这个四氨基酸短序列在所有已知冠状病毒Spike蛋白中，甚至在所有已知病毒各蛋白中也极有可能是独一无二的。已有许多论文做过生物数据库搜索、匹配研究，但未见有论文报告、指出，在任何其它病毒某蛋白中也存在PRRA序列。下一篇文章将说明，虽然不存在于其它病毒之中，但SARS-CoV-2特有的四氨基酸插入PRRA及其延长的六氨基酸序列PRRARS却存在于两种人类蛋白中。
（未完待续）
